- 2021-10-23 08:00:00
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近日，武漢友芝友生物制藥有限公司（以下簡稱“友芝友生物”）分析與質控團隊完成了報告基因法檢測CD38×CD3雙特異抗體生物學活性的研究,其研究論文 “Development of a Reporter Gene Method to Measure the Bioactivity of Anti-CD38×CD3 Bispecific Antibody” 發表于Antibody Therapeutics期刊上。
友(you)芝友(you)生(sheng)(sheng)物自主研發的(de)(de)抗(kang)(kang)CD38×CD3雙抗(kang)(kang)體(ti)（Y150）是(shi)基于(yu)(yu)YBODY®平臺技術開發的(de)(de)非對稱性雙特異(yi)(yi)性抗(kang)(kang)體(ti)。體(ti)內(nei)外研究表明，Y150能(neng)激活(huo)T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，并有(you)效(xiao)殺(sha)傷表達(da)CD38的(de)(de)腫(zhong)瘤(liu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)。在雙抗(kang)(kang)的(de)(de)開發過程中，建立(li)一種(zhong)能(neng)反映(ying)雙抗(kang)(kang)體(ti)作(zuo)用(yong)機制（MOA）的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)生(sheng)(sheng)物學活(huo)性評(ping)價方法(fa)非常重要。基于(yu)(yu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)毒性的(de)(de)檢測(ce)方法(fa)如CCK-8，MTS，MTT，LDH等(deng)，可以(yi)(yi)以(yi)(yi)外周(zhou)血(xue)單核細(xi)(xi)胞(bao)(bao)（PBMC）或T細(xi)(xi)胞(bao)(bao)和細(xi)(xi)胞(bao)(bao)因(yin)子(zi)誘導的(de)(de)殺(sha)傷細(xi)(xi)胞(bao)(bao)（CIK）為效(xiao)應細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，直接檢測(ce)對腫(zhong)瘤(liu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)殺(sha)傷作(zuo)用(yong)，但由于(yu)(yu)這些效(xiao)應細(xi)(xi)胞(bao)(bao)難以(yi)(yi)獲取，且存在較大的(de)(de)個體(ti)差異(yi)(yi)，因(yin)此不適合作(zuo)為雙抗(kang)(kang)生(sheng)(sheng)物學活(huo)性的(de)(de)評(ping)價方法(fa)。
近年來，基于(yu)細(xi)(xi)胞(bao)水(shui)平的(de)(de)(de)報告基因法廣泛應(ying)用于(yu)檢測單克(ke)隆抗體和雙抗的(de)(de)(de)生物(wu)(wu)(wu)學(xue)活(huo)性(xing)。檢測以CD3為靶點的(de)(de)(de)雙抗時(shi)，雙抗一端與(yu)腫(zhong)瘤細(xi)(xi)胞(bao)相關的(de)(de)(de)靶點結合(he)，另一端與(yu)工程改造的(de)(de)(de)Jurkat T細(xi)(xi)胞(bao)上的(de)(de)(de)CD3結合(he)，激(ji)活(huo)T細(xi)(xi)胞(bao)反應(ying)元件（NFAT-RE）介導表達的(de)(de)(de)螢(ying)光(guang)素(su)酶(mei)，與(yu)外加的(de)(de)(de)螢(ying)光(guang)素(su)酶(mei)底(di)物(wu)(wu)(wu)反應(ying)，其化(hua)學(xue)發光(guang)強度可定量檢測雙抗的(de)(de)(de)生物(wu)(wu)(wu)學(xue)活(huo)性(xing)（圖1）。
圖1 報告基因法(fa)檢測(ce)CD3靶(ba)點雙(shuang)抗(kang)生物學活性
當采用報(bao)告(gao)基因法檢測(ce)Y150的(de)生物(wu)學活性時，由于Jurkat T細(xi)胞(bao)上(shang)同時表(biao)(biao)達(da)CD38和CD3，在沒(mei)有腫瘤細(xi)胞(bao)存(cun)在的(de)條件(jian)下(xia)，兩個(ge)Jurkat T細(xi)胞(bao)會通過雙抗(kang)的(de)連接(jie)而自我激活，產生非特(te)(te)異性信號，從而干擾實驗(yan)(yan)（圖2，綠色(se)(se)(se)）。利(li)用CRISPR-Cas9技術敲除Jurkat T細(xi)胞(bao)上(shang)CD38的(de)表(biao)(biao)達(da)，并構(gou)建穩定(ding)的(de)單(dan)克隆細(xi)胞(bao)株進行(xing)Y150生物(wu)學活性檢測(ce)（圖2，藍色(se)(se)(se)），成功消除了非特(te)(te)異性信號（圖2，棕色(se)(se)(se)）。該(gai)方(fang)法操(cao)作簡便，檢測(ce)時間周(zhou)期較短，分(fen)析方(fang)法驗(yan)(yan)證(zheng)結(jie)果(guo)表(biao)(biao)明(ming)該(gai)方(fang)法在50%-200%范圍內(nei)具(ju)有良(liang)好的(de)準確度(du)、精密(mi)度(du)、線性，以及穩健性（表(biao)(biao)1），可用于抗(kang)CD38×CD3雙抗(kang)體的(de)QC放行(xing)檢測(ce)和穩定(ding)性研究。
圖2 Y150報告基(ji)因法(fa)檢測Y150生物(wu)學活性方法(fa)建立
表1 報(bao)告基因法檢測Y150生(sheng)物學活性(xing)方(fang)法學驗證(zheng)結(jie)果(guo)
在(zai)Y150的高溫穩定(ding)性(xing)研(yan)究(jiu)中(zhong)，報(bao)告基因(yin)法(fa)、細(xi)胞(bao)殺傷(shang)法(fa)和(he)ELISA法(fa)測定(ding)的結(jie)果與(yu)CEX-HPLC法(fa)測定(ding)的電(dian)荷異(yi)質體(ti)之間(jian)存在(zai)高度相關(guan)性(xing)，生(sheng)物學活性(xing)或相對結(jie)合活性(xing)的降低與(yu)酸性(xing)電(dian)荷異(yi)質體(ti)的增加呈(cheng)線(xian)性(xing)相關(guan)，且這(zhe)三種活性(xing)檢測法(fa)測定(ding)的相對效價(jia)變化趨勢一致(zhi)（圖3），進一步說明本研(yan)究(jiu)建立(li)的報(bao)告基因(yin)檢測可以反映Y150的作用(yong)機制，能反應(ying)T-細(xi)胞(bao)招募類雙(shuang)抗(kang)體(ti)雙(shuang)靶點的協同效應(ying)，用(yong)于其生(sheng)物學活性(xing)的評(ping)估及質量(liang)控制。
圖3 三種活性(xing)檢測方(fang)法(fa)相關(guan)性(xing)研(yan)究結果
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